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PRODUCT CENTER
| 價格 | ￥6800.00 |
| 品牌 | NewEast Biosciences  |
| 產(chǎn)地 | 中國 武漢 |
| 貨號 | 82901 |
| 規(guī)格 | 30 Assays |
| 說明書 | 說明書下載 |
Arl1 Pulldown Assay Kit
Catalog Number：NST-82901
30 assays
產(chǎn)品說明
Arf-like protein (Arl1)是調(diào)控GTPases的Arf家族成員，位于GTPases的Ras超家族中，在真核生物中具有高度保守的同源性。在果蠅和秀麗隱桿線蟲的早期胚胎發(fā)育中，Arl1是必不可少的。Arl1在初級序列、細(xì)胞位置和功能(調(diào)節(jié)膜交通)方面與Arf1-6最相似，甚至有幾個共同的結(jié)合伙伴。除了在高爾基/反高爾基網(wǎng)絡(luò)的膜傳輸中發(fā)揮作用外，有報道表明Arl1可能在酵母離子穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。目前還沒有直接的方法來檢測Arl1 GTPases的激活。
而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Arl1 活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的Arl1 GTP 結(jié)合蛋白，而不識別Arl1
GDP 結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡單并且快速的進(jìn)行Arl1的活性檢測。同時試劑盒中的Arl1 GTP 單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實驗中細(xì)胞和組織中Arl1的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進(jìn)行 30 次檢測。
檢測原理
武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Arl1 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的Arl1 GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理）活性 Arl1 GTP 的水平。簡言之，特異性識別 Arl1 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的 Arl3 GTP 活性蛋白，然后利用 Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用識別 Arl1的鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測。
試劑盒組份及保存
試劑盒所需自備物品
1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制劑；
3. 4 °C 搖桿或者搖床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；
8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；
9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；
10 ECL 檢測試劑；
實驗操作步驟
A 試劑制備
1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。
B 樣品處理
貼壁細(xì)胞
1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。
2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。
5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。
6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因 組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
懸浮細(xì)胞
1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。
2. 計數(shù)細(xì)胞后離心。
3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。
6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，
將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）
注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的Arl1被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的Arl1 被激活。
1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的Arl1 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。
2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。
3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。
4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。
5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。
D. 激活Arl1的親和沉淀
1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。
2. 用 1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的體積調(diào)整到1ml
3. 向管中加入 1ul 的活性 Arl1 單克隆抗體。(Cat.# 26924)
4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，
5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。
6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進(jìn)行搖動。
7. 5000g，離心 1 分鐘。
8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。
9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。
10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。
11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。
12. 樣品煮沸 5min。
13. 5000g，離心 10s。
E. 蛋白印跡實驗
1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。
2. 按照制造商的說明進(jìn)行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。
4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。
5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。
6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Arl1 MAb(Cat.# 26056),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Arl1 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.
8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。
10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Arl1活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。
Arl1活性分析
純化的GST-Arl1蛋白 用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的Arl1單抗(Cat No.26924)進(jìn)行免疫沉淀.用 Anti Arl1 Mouse Monoclonal Antibody(Cat. No. 26056). 做免疫印跡分析。
最底部圖片；純化的GST-Arl1蛋白蛋白用 Anti Arl1 Mouse Monoclonal Antibody(Cat. No. 26056).免疫印跡作參照
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示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Arl1活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。
Arl1活性分析
純化的GST-Arl1蛋白 用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的Arl1單抗(Cat No.26924)進(jìn)行免疫沉淀.用 Anti Arl1 Mouse Monoclonal Antibody(Cat. No. 26056). 做免疫印跡分析。
最底部圖片；純化的GST-Arl1蛋白蛋白用 Anti Arl1 Mouse Monoclonal Antibody(Cat. No. 26056).免疫印跡作參照
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