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G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本原理與研究

                   ——一種高度靈敏的基于特異性單克隆抗體的檢測(cè)方法

 

 

 

來(lái)自細(xì)胞外的信號(hào)絕大多數(shù)都是要通過(guò)分布于細(xì)胞表面的各種受體傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部,從而引起細(xì)胞的生理反應(yīng),發(fā)揮相應(yīng)的功能。

 

細(xì)胞表面最大的受體家族就是G蛋白偶聯(lián)的受體(G-Protein-Coupled Receptors, GPCRs)。編碼GPCR的基因有1000多個(gè),占人類基因組總數(shù)超過(guò)2%。GPCR是一種7次跨膜蛋白。人類GPCR蛋白至少有數(shù)千種。GPCR被根據(jù)序列同源性被分為3個(gè)大家族:A,BC。在各個(gè)家族內(nèi)部成員之間在跨膜的核心區(qū)域至少具有25%的序列同源性,并且在一些關(guān)鍵部位的氨基酸是高度保守的。

 

G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)需要通過(guò)異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G-Proteins)傳遞到下游的效應(yīng)蛋白(Effectors)。異源三聚體G蛋白有不同的Ga、GbGg亞基組成。Ga 亞基較大(~35-55 kDa),并具有鳥嘌呤核苷酸結(jié)合和水解能力。在大多數(shù)情況下,當(dāng)Ga 亞基結(jié)合著鳥嘌呤二磷酸核苷酸(GDP)的時(shí)候,能夠結(jié)合一個(gè) Gb 亞基(~35 kDa)和一個(gè) Gg 亞基(~8 kDa)形成異源三聚體復(fù)合物。當(dāng)Ga亞基結(jié)合鳥嘌呤三磷酸核苷酸(GTP)的時(shí)候,Ga 亞基便同Gbg 復(fù)合物分離,形成分別具有獨(dú)立信號(hào)傳導(dǎo)功能的兩個(gè)復(fù)合物。但是Ga亞基具有內(nèi)在的GTP水解活性,能夠催化GTP水解為GDP,從而導(dǎo)致三聚體回到相對(duì)沒(méi)有活性的GDP結(jié)合狀態(tài)。多數(shù)情況下結(jié)合著GTPGa 亞基是活化的,能夠調(diào)節(jié)下游的效應(yīng)蛋白的活性;而結(jié)合GDPGa亞基只有在極少數(shù)情況下可能具有活性。

 

典型的G蛋白偶聯(lián)受體傳遞信號(hào)的基本原理是:特異性的配體結(jié)合到相應(yīng)的7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)上,引起GPCR構(gòu)象的變化;構(gòu)象變化之后的GPCR能夠結(jié)合相應(yīng)的GDP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白,并誘導(dǎo)三聚體的Ga 亞基構(gòu)象發(fā)生變化,釋放結(jié)合的GDP。處于空置狀態(tài)的Ga 亞基迅速與周圍環(huán)境中的GTP結(jié)合。結(jié)合了GTPGa 亞基立即與GPCRGbg亞基復(fù)合物分離(如圖)。自由的Ga 亞基和Gbg 亞基分別與下游的效應(yīng)蛋白結(jié)合,通過(guò)調(diào)控效應(yīng)蛋白的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ga 亞基在同效應(yīng)蛋白結(jié)合的同時(shí)或者之后,水解結(jié)合的GTP成為GDP,于是Ga 亞基在自身的調(diào)節(jié)下關(guān)閉功能,回到非活性的GDP結(jié)合狀態(tài),并與Gbg 亞基形成三聚體,等待下一次信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。三聚體G蛋白就是通過(guò)這樣的循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)分子信號(hào)的“開”與“關(guān)”,從而使得信號(hào)能夠得到正確有效的傳導(dǎo)。

 

為了表彰Martin RodbellAlfred G. Gillman對(duì)于發(fā)現(xiàn)和揭示三聚體G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的開創(chuàng)性工作,諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)把1994年的生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予這兩科學(xué)家

         

GPCR結(jié)合催化三聚體G蛋白交換鳥嘌呤核苷酸示意圖。

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GPCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)對(duì)于藥物研發(fā)具有非常重要的意義。但是,GPCR的結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜性,以至于盡管GPCR1870年代就被發(fā)現(xiàn)了,但是對(duì)于其結(jié)構(gòu)和工作原理的了解也只是集中于最近40多年,并且到目前對(duì)于其結(jié)構(gòu)還有很多不清楚的地方。以Brian K. KobilkaRobert J. Lefkowitz為首的科學(xué)家在GPCR的研究中做出了巨大的貢獻(xiàn)。為了表彰他們研究成果和長(zhǎng)期的努力,2012年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)被授予這兩位科學(xué)家。

 

除了三聚體G蛋白以外,小G蛋白也是一種具有內(nèi)在GTPase活性的鳥苷酸結(jié)合蛋白。他們也能結(jié)合GTP,并將GTP水解成為GDP,實(shí)現(xiàn)類似于三聚體G蛋白的核苷酸循環(huán),作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)通路。與三聚體核鳥苷酸結(jié)合蛋白不同的是,他們是以單體的形式存在,并且分子量較小,大多在20-25kDa之間;他們一般不是像三聚體G蛋白那樣直接與受體結(jié)合介導(dǎo)來(lái)自受體的信號(hào),而是在細(xì)胞內(nèi)間接傳遞來(lái)自胞外的信號(hào)。由于最先發(fā)現(xiàn)的小G蛋白是Ras,因此小G蛋白家族也被稱為RAS蛋白超家族。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了154種之多的小G蛋白。這些小G蛋白被分為Ras、RhoRab、ArfRan5個(gè)家族。小G蛋白存在于從低等的原核生物到人類之間。小G蛋白有著非常重要的生理功能。有15%的人類腫瘤都與小G蛋白的突變有關(guān)。各個(gè)家族的G蛋白細(xì)胞功能分工有所不同。Ras家族的蛋白調(diào)控基因表達(dá);Rho家族的蛋白調(diào)控細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)和基因表達(dá);RabArf家族蛋白調(diào)控細(xì)胞內(nèi)小體的轉(zhuǎn)運(yùn);Ran家族蛋白調(diào)控細(xì)胞周期中G1、SG2期的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及M期的微管的形成。

 

         圍繞GPCRG蛋白的研究的核心問(wèn)題之一就是:如何能夠檢測(cè)到GPCR或者說(shuō)G蛋白是否被激活?這是所有研究G蛋白的科學(xué)家都面臨的一個(gè)非常現(xiàn)實(shí)的問(wèn)題。然而,傳統(tǒng)的檢測(cè)手段,例如同位素標(biāo)記的核苷酸,熒光標(biāo)記核苷酸,或者分光光度法,要么操作繁瑣難度大,要么靈敏度不夠,都不盡如人意。最近,NewEast Biosciences的科學(xué)家發(fā)明了一種高度靈敏的基于特異性單克隆抗體的檢測(cè)方法。該方法基于能夠特異性識(shí)別GTP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體,利用方便快捷的試劑盒,能夠迅速檢測(cè)出G蛋白是否處于激活狀態(tài)。該方法除了具有簡(jiǎn)單、易操作、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)以外,還有一個(gè)最為吸引人的優(yōu)勢(shì):具有捕捉到被固定的細(xì)胞內(nèi)的G蛋白的活化狀態(tài)的可能性。而這正是很多研究G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的科學(xué)家所夢(mèng)寐以求的功能。目前,該類型試劑盒已經(jīng)被100多篇高水平研究論文所引用。隨著這些檢測(cè)方法的普及,G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究進(jìn)展必將進(jìn)一步加快。

 

 

參考文獻(xiàn)

 

1. Gilman, AG (1987) G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu Rev Biochem 56, 615-649.

2. Lefkowitz RJ (2004) Histrorical review; A brief history and personal retrospective of seven-  

           transmembrane receptors. Trends Pharmacol Sci 25, 413-422.

3. Lefkowitz RJ (2007) Seven-transmembrane receptors: something old, something new. Acta

           Physiol 190, 9-19.

4. Shoichet BK, Kobilka BK (2012) Structure-based drug screening for G-protein-coupled

           receptors. Trends Pharmacol Sci 33(5), 268-272.

5. Ye S, Zaitseva E, Caltabiano G, Schertler GF, Sakmar TP, Deupi X, Vogel R (2010) 


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