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Cdc42 Pulldown Activation Assay Kit

Catalog Number：80701 

30 assay

 

產(chǎn)品說明

      

        小G蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族，它在細(xì)胞運動、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種， Cdc42參與生理活動過程中其分子結(jié)構(gòu)會呈現(xiàn)出2種相互轉(zhuǎn)換的形式：與GTP結(jié)合的激活狀態(tài)和與GDP結(jié)合的非活性狀態(tài)。

 

   目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結(jié)合區(qū)域（PBD）結(jié)合，使PAK活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而間接的進(jìn)行Cdc42活性功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結(jié)合蛋白與p21結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測方法的重復(fù)性較差。

 

   紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Cdc42活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別Cdc42-GTP結(jié)合蛋白，而不識別Cdc42-GDP結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡單并且快速的進(jìn)行Cdc42的活性檢測。同時試劑盒中的Cdc42-GTP單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實驗中細(xì)胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進(jìn)行30次檢測。

 

檢測原理

     

   武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Cdc42活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異形態(tài)的Cdc42-GTP單克隆抗體特異性的去檢測細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行GTPγS活化處理）活性Cdc42-GTP的水平。簡言之，特異性識別Cdc42活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白，然后利用Protein A/G將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用識別Cdc42 兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測。

 

試劑盒組分及儲存

 

名稱	貨號	規(guī)格	儲存溫度
Anti-active Cdc42 mouse Monoclonal antibody	Cat.#26905	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lYsis Buffer	Cat.#30303	1x30ml	4℃
Anti-Cdc42 Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#21010	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#29002	1x50ul	-20℃

 

注意:使用前應(yīng)將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。

 

試劑盒所需自備物品

1.刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

實驗操作步驟

 

A  試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B  樣品處理

  貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因    組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

懸浮細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 計數(shù)細(xì)胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，

  將細(xì)胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 Cdc42 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Cdc42 被激活。 

1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的 Cdc42 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D. 激活Cdc42的親和沉淀

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。將每個樣品中的體積調(diào)整到1mL

3. 向管中加入 1ul 的活性 Cdc42 單克隆抗體。(Cat.# 26905)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進(jìn)行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進(jìn)行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Cdc42 pAb(Cat.# 21010),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

6. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

 

   示例結(jié)果

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Cdc42活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用表皮細(xì)胞因子（EGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26905)孵育(上圖)。親和沉淀物用 Anti-Cdc42 pAb(Cat # 21010)進(jìn)行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細(xì)胞裂解液的活性Cdc42的Western blot實驗結(jié)果。（底圖SDS-PAGE的上樣量是上圖SDS-PAGE上樣量的5%。）

 

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Catalog#	Name	Size	Price
80701	Cdc42 Activation Assay Kit	30 assays	￥6800
26905	Active Cdc42-GTP Monoclonal Antibody	30 μL	￥4800
26008	Anti-Cdc42 Mouse Monoclonal Antibody	100 μL	￥1600
21010	Anti-Cdc42 Rabbit Polyclonal Antibody	100 μL	￥1600

 

 

 

 

 示例結(jié)果

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Cdc42活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用表皮細(xì)胞因子（EGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識別Cdc42活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26905)孵育(上圖)。親和沉淀物用 Anti-Cdc42 pAb(Cat # 21010)進(jìn)行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細(xì)胞裂解液的活性Cdc42的Western blot實驗結(jié)果。（底圖SDS-PAGE的上樣量是上圖SDS-PAGE上樣量的5%。）