該免疫組化實驗方法僅供參考，由于每個實驗使用的試劑不同，并且涉及不同的物種，組織類型及實驗應用，實驗人員設計應根據(jù)具體情況設計實驗步驟和改良。

所需試劑

• 丙酮

• 乙醇，無水變性的，組織學分級 (100% 和 95%)

• 蒸餾水

• 蘇木精

• 二甲苯

• 10X TBS: 制備 1 升10X TBS：24.2g Tris base, 80g NaCl; 用HCl (使用 1X) 將pH 調至 7.6 。

• 洗滌液 TBS/T: 1X TBS, 0.1% Tween-20: 制備 1 升需將100ml 的 10x TBS 加入到 900 ml 雙蒸餾水中。加入1ml Tween 20 然后混合。

• 10 mM 檸檬酸鈉緩沖液： 制備 1 升需將 2.94g 檸檬酸鈉加入到 1 升的蒸餾水中。將 pH 調至 6.0。

• 3% 過氧化氫： 制備需將10ml 30% H2O2 加入到 90ml 蒸餾水中。

• 封閉液: 5% 馬血清或山羊血清溶于TBS

• ABC 試劑: 在使用前30分鐘根據(jù)制造商說明制備。

• DAB 試劑: 根據(jù)制造商說明制備。

組織制備

A. 新鮮冷凍切片

組織制備

1. 在液氮中將組織切成小塊 (5 mm x 5 mm x 3 mm)。

2. 轉移到恒冷箱切片機中, 切成5–30 μm薄的切片，將切片轉移至帶正電荷的載玻片上 (poly-L-lysine 包被的).

3. 室溫下干燥切片 (若當天染色則干燥1-2 小時，直至完全干燥)。注意：徹底干燥才能保證組織恰當?shù)卣掣皆谇衅稀?/p>

固定方法

可用的固定方法有很多種. 應遵循產品說明書上指定的方法或找到適宜樣品的最佳方案。

• 冷丙酮: -20°C處理10分鐘。自然干燥。

• 甲醇: -20°C處理10分鐘。

• 10% 中性甲醛溶液: 室溫下10分鐘。

• 3% 甲醛: 室溫下15分鐘。

• 3% 甲醛/甲醇: 室溫下15分鐘，然后用甲醇 -20°C處理 5 分鐘 (中間不要漂洗)。

用PBS （pH 7.4 含1% Tween 20）漂洗切片3次，每次5分鐘。

B. 固定的, 冷凍組織切片

1. 使組織充滿固定劑或將組織浸入到固定劑中一段時間。最常用的固定劑是4% 多聚甲醛。

2. 將組織浸沒于凍存保護液（其中含有含10-30%蔗糖的PBS）中。當組織沉入溶液中后凍存保護就完成了。

3. 從凍存保護液中取出組織，保存于 -70°C 直到切片。

4. 將組織從 -70°C 冰箱取出，在-20°C平衡15分鐘 然后再切片。-20°C平衡幫助避免切片時的斷裂。

5. 用恒冷箱切片機將組織切成 10-15um 的切片，收集切片置于載玻片上。通常每個載玻片可以放置3片切片，留出足夠間距。

6. 充分干燥切片?？墒褂米匀伙L干或切片加熱器，通常需要過夜或在40-50°C下至少干燥2~3小時。

7. 制好的切片可以干燥保存在 -70°C 直至染色。 在復水染色前要先平衡至室溫并適當干燥。

C. 石蠟包埋切片

脫蠟和水化切片

1. 二甲苯：換 2-3 次，每次5分鐘。

2. 100% 純乙醇：換2次，每次3分鐘。

3. 95% 乙醇: 換2次，每次3分鐘。

4. 80% 乙醇：3分鐘。

5. 50% 乙醇：3分鐘。

6. 蒸餾水，PBS，或 Tris buffer：換2次，每次3分鐘。

注意: 一旦組織切片復水，不要使之干透。用吸水紙吸干組織切片周圍。用鉆石劃針，免疫組化筆，陶瓷記號筆, 或指甲油在載玻片上將切片圈起來。這個圈可以在接下來的孵育過程中使溶液留存于切片上。

抗原修復

很多抗原的可視性可以通過抗原修復來提高，抗原修復可以打破福爾馬林固定時形成的蛋白質交聯(lián)，從而使被掩藏的抗原顯現(xiàn)出來?？乖迯图夹g包括不同時間長度的加熱或者利用蛋白酶來做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。

加熱的方法通常會用到微波爐，高壓鍋，蒸箱或水浴。將樣品在接近100°C高溫加熱20分鐘后再冷卻同等的時間。最常用的抗原修復液有 a) 檸檬酸鹽緩沖劑, pH 6.0, b) Tris-EDTA, pH 9.0 和 c) EDTA, pH 8.0.

如需要可用檸檬酸鹽緩沖劑做抗原修復：

檸檬酸鹽緩沖劑配方:

• 10mM 檸檬酸鈉, 0.05% Tween-20, pH 6.0 或

• 10mM 檸檬酸, 0.05% Tween-20, pH 6.0

1. 將含有檸檬酸鈉或檸檬酸鹽緩沖劑的染色盤放到蒸箱或者水浴中，預熱到95-100 °C。

2. 將切片浸沒于染色盤中。蓋子虛掩，孵育20-40 分鐘 (研究者需自己決定最佳的孵育時間)。

3. 關掉蒸箱或水浴，將染色盤置于室溫下，讓切片冷卻20分鐘。

4. 在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分鐘。

5. 開始封閉步驟。

過氧化氫孵育

阻斷內源性過氧化物酶 (如需要):

1. 將切片浸入到 0.3-3% H2O2 和 100% 甲醇中，室溫下10-30 分鐘。

2. 在蒸餾水中漂洗切片，換2次，每次5分鐘。

免疫組化實驗方案

封閉步驟:

1. 用3-10% 來自二抗宿主物種的正常血清孵育切片30分鐘，以阻斷非特異的抗體結合。

2. 移去封閉液。

一抗孵育

*所有步驟需在濕潤的環(huán)境中進行。

1. 在封閉液中稀釋一抗。如果沒有建議的稀釋度，從 1:10, 1:100 和 1:1000開始。

2. 4°C 孵育過夜。

3. 移去抗體溶液。用PBS，pH 7.4 洗滌3次，每次5分鐘。

4. 如果一抗是HRP-標記的，直接開始顯色步驟。

二抗孵育

1. 根據(jù)建議的稀釋度在封閉液中稀釋生物素-標記的二抗。室溫下孵育 30-60 分鐘。

2. 移去二抗溶液。在洗滌液中清洗3次，每次5分鐘。

顯色

1. 向每個切片中加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶試劑，室溫下孵育30分鐘。

2. 移去 ABC 試劑。用洗滌液清洗切片3次，每次5分鐘。

3. 在濕潤的環(huán)境下用 DAB 溶液徹底覆蓋切片。室溫下孵育 5-15 分鐘?；蛘撸陲@微鏡下觀察切片來決定最佳的不溶沉淀物顏色深度。

4. 一旦顯色，用蒸餾水小心沖洗以終止反應。

5. 如需要可以用蘇木精和曙紅對組織進行復染色。

6. 用蒸餾水清洗切片。

復水以及加蓋玻片

1. 樣品復水：使用一系列不同濃度的甲醇或乙醇- 50% (2 x 5 min), 75% (2 x 5 min), 最后 100% (2 x 5 min)。

2. 用二甲苯重復上述步驟，孵育切片兩次，每次10秒鐘。

3. 使切片自然干燥。

4. 用合適的固定介質固定好蓋玻片。