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產(chǎn)品中心

PRODUCT CENTER

cGMP ELISA Kit

價(jià)格￥3800.00
品牌NewEast Biosciences    
產(chǎn)地中國 武漢
貨號(hào)80103
規(guī)格96T
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  • 產(chǎn)品描述
  • 產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)圖文
  • 通路和蛋白
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    Direct cGMP ELISA Kit
    (New Non-acetylated Version)
    Catalog No.80103
    96 Well Kit

     

    靈敏度：14fmol/ml    檢測范圍：0.016pmol/ml-250pmol/ml

     

    產(chǎn)品描述

     

         環(huán)磷腺苷酸(cAMP)和環(huán)磷鳥苷酸 (cGMP)是在通過對(duì)特定蛋白激酶作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的過程中非常重要的第二信使分子。兩者都富含于中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中 ,AMP 參與較高的皮質(zhì)功能,而cGMP參與光轉(zhuǎn)導(dǎo)。cAMP 是三磷酸腺苷(ATP)的衍生物,在多 種不同生物體的細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo) cAMP 依賴的信號(hào)
    轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。cAMP參與細(xì)胞代謝,分化,增殖的跨膜調(diào)控機(jī)制在惡性生長中具有良好的細(xì)胞抑制和調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡的作用。
         目前商業(yè)化提供的一些 cGMP檢測試劑盒主要使用的是非親和純化的 cGMP多克隆抗體。盡管稱有特異性,但這些多克隆抗 cGMP抗體與 cAMP和 GTP呈現(xiàn)一定程度的交叉反應(yīng)。且在大多數(shù)細(xì)胞類型中 ,cGMP含量低于cAMP 100倍。紐斯特生物的cGMP ELISA 檢測試劑盒使用的是獨(dú)一無二的鼠單克隆抗cGMP抗體,該單克隆 cGMP抗體的特異性比cAMP,GTP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體 cGMP試劑盒 . 紐斯特生物 cGMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性 ,且能有效避免來自動(dòng)物多克隆抗體的批次間差異, 因此可以提供長久有效地可重復(fù)性定量檢測。此外,其他ELISA試劑盒的多克隆抗cGMP抗體與乙酰化cGMP的親和力明顯高于非乙酰化 cGMP, 而本試劑盒的單克隆cGMP抗體與乙?；蚍且阴；痗GMP具有同樣的親和力。        因此,紐斯特生物cGMP ELISA試劑盒中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品不需要乙?；幚?從而明顯縮短了分析時(shí)間 ,有效避免了乙?；^程中的有機(jī)試劑的使用 ,為大家提供了一個(gè)更安全,更健康的工作環(huán)境。

     

       

    工作原理

     

           本試劑盒利用競爭酶聯(lián)免疫分析方法來測定細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP的 水平。簡而言之 ，將羊抗鼠多克隆抗體包被在酶標(biāo)板上 ,細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的 cGMP與固定數(shù)量的偶聯(lián)辣根過氧化物酶的cGMP或堿性磷酸酶競爭性的結(jié)合抗cGMP單克隆抗體 ,已知的cGMP作為標(biāo)準(zhǔn)品來做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過一段時(shí)間孵育 ，洗掉所有試劑 ,加入底物進(jìn)行顯色。將多孔板置于酶標(biāo)儀上,于450nm或405nm波長下,進(jìn)行讀數(shù)。黃色的光強(qiáng)度與樣品中cGMP的濃度呈反比關(guān)系?；赾GMP標(biāo)準(zhǔn)品所得曲線, 通過測得的光密度可以計(jì)算出樣品中cGMP的濃度。

     

     

    研究背景

         
          cGMP作為獨(dú)特的第二信使 ，可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)各種外源和內(nèi)源信號(hào)分子的反應(yīng)。 cGMP主要通過激活蛋白激酶，控制特定的離子通道、磷酸二酯酶調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)核苷酸濃度來調(diào)節(jié)不同的生理過程 (8) ,如血管平滑肌松弛，上皮細(xì)胞電解質(zhì)運(yùn)輸,骨生長, 白細(xì)胞遷移、軸突引導(dǎo)、精子運(yùn)動(dòng)，血小板蔓延以及血
    管通透性等。通過鳥苷酸環(huán)化酶可以實(shí)現(xiàn)GTP轉(zhuǎn)化為cGMP。在哺乳動(dòng)物中存在2種類型的鳥苷酸環(huán)化酶: 可溶性及膜結(jié)合的鳥苷酸 環(huán)化酶(8,10,11)。可溶性環(huán)化酶在一氧化氮與血紅素輔基結(jié)合后即被激活。七層膜結(jié)合鳥苷酸環(huán)化酶 (即跨膜鳥苷酸環(huán)化酶或鳥苷酸環(huán)化酶微粒)已被證實(shí)存在于人類基因組中，
    鳥苷酸環(huán)化酶A和B是利尿鈉肽受體，鳥苷酸環(huán)化酶C能被熱穩(wěn)定細(xì)菌腸毒素、鳥苷素和脲激活?？缒B苷酸環(huán)化酶的活性亦受胞內(nèi)信號(hào)通路的其他受體信號(hào)所調(diào)控。

     

    試劑盒組份及保存

     

          注： 收到試劑盒后 ，若不立即使用 ，請(qǐng)按照標(biāo)簽說明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度。 

     

    試劑盒所需自備物品

     

    1.去離子水或蒸餾水。
    2. 量程在5μ L至1000μ L之間的精密移液管。
    3. 量程為50μ L和200μ L的中繼移液器。
    4. 用于稀釋儲(chǔ)液的一次性燒杯。
    5. 刻度量筒。
    6. 微孔板振蕩器。
    7. 吸水紙。
    8. 酶標(biāo)儀 ，可讀波長450nm ，在570nm至590nm之間應(yīng)有修正。

     

    樣品處理

          

         

         紐斯特生物的ELISA試劑盒適用于檢測經(jīng)過鹽酸處理而終止內(nèi)源性磷酸二酯酶活性的cAMP樣品。 這種樣品可直接應(yīng)用于檢測，而不需要蒸發(fā)和進(jìn)一步的處理。

    組織樣本：需預(yù)先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細(xì)粉末，待液氮揮發(fā)完后，稱量凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心，取上 層清夜用0.1M HCl稀釋至適當(dāng)濃度。
    細(xì)胞樣本：首先移除培養(yǎng)基，然后加入0.1M HCl處理細(xì)胞。孵育10分鐘 并觀察細(xì)胞是否被裂解；如果裂解充分 ，接著孵育10分鐘并觀察。以大于600g離心力于室溫離心，收集上清直接用于實(shí)驗(yàn)。臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強(qiáng)細(xì)胞 和組織裂解。
    尿液，血漿和培養(yǎng)液：每ml樣品中加入10µL濃鹽酸（12M）混勻后，室溫離心5min（600 g）留上清，用于試劑盒檢測。血漿、血清，全血和組織勻漿通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig)它們會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)。用0.1 M HCl處理樣品，可以滅活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的濃度，使之可以用于本試劑盒。

     

     試劑盒注意事項(xiàng)

     

    1. 收到試劑盒后若不立即使用 ，請(qǐng)將試劑按照標(biāo)簽說明存儲(chǔ)在相應(yīng)的溫度 ， -80℃低溫保存的抗體和 酶
    儲(chǔ)液為避免反復(fù)凍融請(qǐng)按每次需要量進(jìn)行分裝凍存；若立即使用，請(qǐng)將整個(gè)試劑盒置于4℃保存。
    2. 使用前請(qǐng)將試劑盒各個(gè)試劑平衡到室溫 (至少30min) 。
    3. 用試劑預(yù)先潤洗槍頭在使用；取各種樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和試劑必需更換槍頭。
    4. 移取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品到微孔底部。
    5. 從微孔的邊緣加入試劑 ，以避免污染。
    6. 本試劑盒使用可拆分的微孔酶標(biāo)條 ，使用者可根據(jù)樣品量多少進(jìn)行拆分。未使用的酶標(biāo)條保持干 燥
    ，密封于試劑盒提供的鋁封袋中 ，于4℃保存。微孔酶標(biāo)條需安裝在相應(yīng)的框架上使用。
    7. 在加入顯色底物前 ，確保微孔內(nèi)沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導(dǎo)致分析結(jié)果的變化。



     試劑準(zhǔn)備

     

     1. 非乙?；痗GMP標(biāo)準(zhǔn)品

     

    將5000 pmol/mL cGMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液平衡至室溫。從#2至#7標(biāo)記七只潔凈管。移取475μ L 0.1MHCl 到 #1號(hào)試管 ，400μl 到 #2至 #7號(hào)試管。加入25μl 5000 pmol/mL cGMP標(biāo)準(zhǔn)品到 #1管中,劇烈渦旋震蕩。從 #1管中取出100 μl溶液至 #2 管中 ，渦旋震蕩，以此類推, 重復(fù)上步操作 ，梯度稀釋至#7管。經(jīng)以上操作 ，#1至 #7 管中cGMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為 250, 50 ，10, 2 , 0.4, 0.08 和 0.016pmol/mL (詳見cGMP實(shí)驗(yàn)稀釋操作流程圖) 。稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品需在30分鐘內(nèi)使用。標(biāo)記 一只試管作為無標(biāo)準(zhǔn)品空白對(duì)照 ( BO) .移 600μl 0.1M HCl 到 B0 管中。

     

                   

     

      2.1xAssay Buffer

     

    將15 mL 10×Assay Buffer 加到135 mL去離子水中 ，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限 ，或者3個(gè)月

     

    3.cGMP-HRP 工作液

     

    實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量 (以50ul/孔計(jì)算) ，實(shí)際配置時(shí)應(yīng)多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1x Assay Buffer,將cGMP-HRP Conjugate ( 1000×) 稀釋成1x工作濃度。 當(dāng)日使用。

     

    4.Anti-cGMP McAb 工作液

     

    實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量 (以50ul/孔計(jì)算) ，實(shí)際配置時(shí)應(yīng)多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1x Assay Buffer,將Anti-cGMP Antibody ( 1000×) 稀釋成1x工作濃度。 當(dāng)日使用。

     

     實(shí)驗(yàn)步驟

      使用前將各種試劑取出放置30分鐘 ，平衡至室溫。所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品必需設(shè)置平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)?？焖偌尤朐噭┲翗悠分?,立即漩渦震蕩2秒混勻。
    1. 依據(jù)實(shí)驗(yàn)鍵盤紙決定酶標(biāo)條的使用量 將剩余的酶標(biāo)條連同干燥劑一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存
    2. 移取50μ L中和液至各個(gè)微孔中，除了 TA ( TotalActivity) 孔 和 Blank (空白)孔。
    3. 移取100μ L 0.1M HCl 至NSB ( Non-Specific Binding) 孔 和 B0孔 (0pmol/mL cGMP標(biāo)準(zhǔn)品)。
    4. 移取100μ L cGMP標(biāo)準(zhǔn)品至相應(yīng)的孔。
    5. 移取100μ L樣品至相應(yīng)的孔。
    6. 移取50μ L 1x Assay Buffer 至NSB ( Non-Specific Binding) 孔。
    7. 移取50μ L偶聯(lián)酶至各孔中 ，除了TA (TotalActivity) 孔和 Blank (空白) 孔。
    8. 移取50μ L 抗體工作液至各孔中，除了TA (TotalActivity) 孔，Blank(空白)孔。
    9. 將酶標(biāo)孔置于孔板振動(dòng)器上 ，250~500rpm ，室溫孵育2小時(shí)。
    10. 在吸水紙上拍干微孔內(nèi)溶液 ，加洗滌液 250 μ L每孔洗3次，每次需拍干。
    11. 最后一次洗滌 ，清空各微孔 ，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標(biāo)板數(shù)次 ，以確保沒有洗滌液殘留。
    12. 加5μ L 偶聯(lián)酶至TA (Total Activity) 孔。
    13. 每孔 200μ L顯色底物溶液 ，于室溫靜置5~30分鐘。(顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內(nèi)等體積混合 ，并避光放置)
    14. 每孔加入50μ L終止液。終止后立即讀數(shù)。
    15. 清除酶標(biāo)儀Blank(空白)孔值 ，讀取450nm處的光密度值 ，在570nm至590nm之間最好有修正。如果酶標(biāo)儀不能自動(dòng)清除Blank(空白)孔值 ，那么手動(dòng)扣除每個(gè)讀數(shù)的Blank(空白)孔光密度值。

     

     

    下面的曲線不能用于計(jì)算cGMP濃度。每次實(shí)驗(yàn)需新做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    QQ截圖20191115102102.png

     

    靈敏度

     

    通過比較10個(gè)B0孔平均光密度值(OD)和10個(gè)#6管標(biāo)準(zhǔn)品的平均光密度值，計(jì)算出靈敏度。cGMP濃度的檢測極限通過標(biāo)準(zhǔn)曲線上0位置的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來測定。

     

                   QQ截圖20191115102102.png

     

    線性關(guān)系

     

    cGMP濃度為16.0pmol/mL的樣品，用0.1M HCl進(jìn)行連續(xù)七次1:2梯度稀釋。將實(shí)際的cGMP濃度和測定的cGMP濃度繪制圖表。該直線的斜率為1.000，相關(guān)系數(shù)為0.999。

     

    交叉反應(yīng)

    部分相關(guān)化合物的交叉反應(yīng)由競爭ELISA測定。將可能的交叉反應(yīng)物溶解到試劑盒分析緩沖液中，濃度從500 pmol/mL至500,000 pmol/mL。將這些樣品用該試劑盒測定，實(shí)測cGMP濃度以50%B/Bo進(jìn)行計(jì)算。交叉反應(yīng)的%通過比較檢測到的交叉反應(yīng)物濃度和實(shí)際的反應(yīng)物濃度得到，并以百分比的形式表示。

     

    QQ截圖20191115102342.png

     

     

     

     

     

     

     

     

     

  • 非乙酰化從GMP ELISA Kit單克隆檢測試劑盒，反應(yīng)靈敏，非乙酰化，健康無污染

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