超值精品推薦：Arf6 Pulldown Activation Assay Kit (高分文獻來幫忙）

    
             ADP 核糖基化因子（Affs) 是真核細胞中廣泛表達的且是高度保守GTP結(jié)合蛋白家族，是Ras超級家族之一。Arfs 蛋白可以分為三類，第一類包括Arf1,Arf2 ,Arf3: 第二類包括Arf4和Arf5 第三類只有Afr6 與其他的 GTP 結(jié)合蛋白一樣，在非活性 GDP 結(jié)合狀態(tài)和活性 GTP 結(jié)合狀態(tài)之間循環(huán)。效應(yīng)蛋白與 GTP 結(jié)合優(yōu)先于 Arf6 的 GDP 結(jié)合狀態(tài)，為 Arf6 在細胞中的功能提供了基礎(chǔ) ，Afr6 是在細胞質(zhì)膜上發(fā)揮功能的Arf 蛋白 GTP 結(jié)合的Arf6 調(diào)節(jié)內(nèi)吞膜的運輸同時調(diào)節(jié)細胞外周的細胞骨架變化，因此分析監(jiān)測Arf6 的激活對研究Arf6 的功能提供了重要的依據(jù)。

           目前市面上常用的是利用效應(yīng)蛋白 GGA3（高爾基體定位的含 γ 耳Arf 結(jié)合蛋白 3）的 Arf6 蛋白結(jié)構(gòu)域 (PBD)，該蛋白已被證明可特異性結(jié)合 GTP 結(jié)合形式Arf6我們結(jié)合純化的 GGA3-PBD，“下拉”Arf6-GTP 并使用 Arf6 特異性抗體通過隨后的蛋白質(zhì)印跡步驟量化活性 Arf6 的水平。
    
           武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Arf6活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的 Arf6-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性 Arf6-GTP 的水平。簡言之，特異性識別 Arf6活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細胞裂解液中的 Arf6-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用特異性識別 Arf6 的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。每個試劑盒可以進行30次免疫親和沉淀檢測 ，同時試劑盒中的 Arf6 GTP 單克隆抗體也可以通過免疫組化和免疫熒光實驗對細胞和組織中 Arf6 的活性進行監(jiān)測。
        
             高分文獻解析

         脂肪肝（Fatty liver disease, FLD）是由于多種原因引起的肝臟細胞內(nèi)脂肪堆積過多的?。ǎ且环N常見的肝臟病理改變，已成為全球肝損傷的主要原因【1】。FLD包括從簡單的脂肪變性到肝臟炎癥和纖維化，進展到晚期纖維化可導(dǎo)致肝硬化和肝細胞癌。有研究報告顯示，F(xiàn)LD相關(guān)的嚴重肝纖維化在世界范圍內(nèi)的患病率預(yù)計將在未來10年內(nèi)翻一番，并成為肝衰竭和癌癥的主要原因，對公共健康造成重大威脅【2】。盡管針對代謝異常的藥物取得了一定的進展，但目前還沒有藥物被批準用于治療FLD【3】。因此，迫切需要開發(fā)新的有效療法和鑒定非侵入性生物標(biāo)志物。
          FLD具有家族聚集現(xiàn)象，有一定的遺傳傾向。迄今為止，PNPLA3、TM6SF2、GCKR、MBOAT7、HSD17B13、MARC1、APOE和GPAM的單核苷酸序列變異已被證明與FLD相關(guān)【4-6】。這些遺傳變異通過改變脂質(zhì)分泌、脂滴重塑或增加脂肪新生來影響肝臟內(nèi)的脂質(zhì)代謝，并導(dǎo)致肝臟炎癥和纖維化，增加FLD發(fā)病和進展的風(fēng)險。雖然近期在該領(lǐng)域取得了一定進展，但迄今確定的常見變異占疾病變異的比例還不到6%【7】，因此，研究人員致力于鑒定和揭示更多未知的影響肝臟脂肪含量的基因位點。
          2022年1月31日，來自瑞典哥德堡大學(xué)的Stefano Romeo 團隊與阿斯利康的Daniel Lindén團隊合作在Nature Metabolism雜志上在線發(fā)表了題為PSD3 downregulation confers protection against fatty liver disease 的研究論文，揭示了Pleckstrin and Sec7 domain-containing 3（PSD3）與FLD的關(guān)系。研究人員在PSD3 基因中鑒定了一個以前未知的與肝臟脂肪含量相關(guān)的基因位點rs71519934，該位點導(dǎo)致PSD3蛋白的186位亮氨酸到蘇氨酸的替換（L186T），從而降低了高危個體對FLD的易感性。機制探究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PSD3可以保護小鼠免受FLD，并防止脂質(zhì)在人原代肝細胞和肝癌細胞中積累。該研究為FLD的治療開辟了新思路。

      為了鑒定先前未知的影響肝臟脂肪含量的基因位點，作者在達拉斯心臟研究（Dallas Heart Study, DHS）隊列（n = 2736）中檢測了候選基因變異與肝臟脂肪含量之間的關(guān)系，并在PSD3基因中發(fā)現(xiàn)了一個變異（rs71519934，L186T）與較低的肝臟脂肪含量相關(guān)（P=0.049）。DHS主要由歐洲裔美國人、非洲裔美國人和西班牙裔美國人組成。按種族分類后分析發(fā)現(xiàn)，PSD3 rs71519934基因型的歐洲美國人的循環(huán)總膽固醇水平有所降低。這些數(shù)據(jù)提示PSD3 rs71519934與FLD相關(guān)。隨后，作者在不同的隊列中進行了驗證，包括（1）肝臟活檢隊列（Liver Biopsy Cohort, LBC; n=1951)——來自北歐和南歐的非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）高危人群；（2）來自英國生物庫隊列的參與者，他們的肝臟脂肪數(shù)據(jù)是可用的（n =10,970）；(3)來自中歐、有肝活檢的肥胖肝病高危人群（n=674）。所有數(shù)據(jù)均顯示PSD3序列變異降低了人類對FLD的易感性，因此，作者后續(xù)工作將重點探究PSD3影響FLD的分子機制。PSD3蛋白有18個注釋的亞型（isoforms），通過檢測來自LBC的77例肝臟活檢組織的轉(zhuǎn)錄組，作者發(fā)現(xiàn)isoform-a（在Ensembl中標(biāo)記為001 ENST00000327040）在肝臟中表達水平最高。值得注意的是，F(xiàn)LD患者肝臟中的PSD3 mRNA水平顯著高于無FLD的患者，而N-acetyltransferase 2（NAT2）mRNA水平?jīng)]有明顯差異；進一步分析發(fā)現(xiàn)，無論是PSD3 mRNA還是NAT2 mRNA在不同PSD3基因型個體中的表達水平均沒有明顯差異。
      作者首先在186L或186T純合人原代肝細胞中探究了rs71519934次等位基因（來自英國生物庫樣本的外顯子組測序顯示，186T是歐洲人的次要等位基因）與低肝脂肪含量之間的關(guān)系。與186L人原代肝細胞相比，2D培養(yǎng)的186T人原代肝細胞中的中性脂質(zhì)脂肪含量降低。作者用不同濃度（0, 10和25 mM）的油酸（oleic acid, OA）培養(yǎng)細胞，并檢測兩種基因型肝細胞中的PSD3蛋白水平，發(fā)現(xiàn)PSD3表達水平隨著OA濃度的增加而升高。然而，對于不同濃度的OA, PSD3蛋白在186T細胞中表達較低。通過RNA-seq分析參與脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的差異表達基因，作者發(fā)現(xiàn)，參與甘油三酯合成和分泌以及膽固醇生物合成的基因表達顯著減少。因此，作者推測PSD3 186T可防止細胞內(nèi)脂質(zhì)累積。由于PSD3在FLD患者肝臟中的表達升高，作者想知道PSD3下調(diào)是否會減少細胞內(nèi)脂肪含量。與預(yù)期一致，在2D培養(yǎng)條件下，PSD3的下調(diào)降低了攜帶186L和186T這兩種等位基因的肝細胞內(nèi)中性脂質(zhì)含量; 然而，當(dāng)在3D球體模型中培養(yǎng)時，PSD3下調(diào)僅降低了攜帶186L等位基因的原代肝細胞的胞內(nèi)脂質(zhì)水平。
       隨后，作者在大鼠（McArdle, McA-RH7777）180T純合子的永生化肝細胞中探究了遺傳關(guān)聯(lián)下的分子機制。結(jié)果顯示，下調(diào)Psd3可以顯著降低細胞內(nèi)中性脂質(zhì)含量、甘油三酯的生成以及參與甘油三酯合成的相關(guān)基因的mRNA表達水平。與對照相比，Psd3敲低的細胞中LDL的分泌也較低，而細胞內(nèi)脂質(zhì)利用并無差異。同時，作者在PSD3 186L等位基因純合子的人肝癌細胞（Huh7 cells）中測量了細胞內(nèi)脂質(zhì)積累和甘油三酯合成，并獲得了與McA-RH7777細胞完全相同的結(jié)果，表明內(nèi)源性Psd3 186T或PSD3186L的下調(diào)導(dǎo)致細胞內(nèi)脂質(zhì)水平降低。PSD3是activating ADP-ribosylation factor 6（ARF6）的鳥嘌呤核苷酸交換因子，PSD3下調(diào)將導(dǎo)致活化的ARF6水平降低。
       最后，作者在小鼠體內(nèi)探究了PSD3下調(diào)與FLD的關(guān)系。對C57BL/6小鼠進行為期50周的NASH（non-alcoholic steatohepatitis，非酒精性脂肪性肝炎）-誘導(dǎo)喂食，在最后16周，將小鼠分為Psd3 ASOs（反義寡核苷酸，可有效敲低內(nèi)源性Psd3）治療組和對照ASO組。數(shù)據(jù)顯示，Psd3 ASO處理可使肝臟Psd3 mRNA表達水平降低98%，進而降低肝臟重量、肝臟總甘油三酯含量和血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase, ALT）水平（Psd3 ASOs不影響小鼠體重）。此外，Psd3 ASO降低了肝臟游離總膽固醇、肝臟膽固醇酯、血漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (aspartate transaminase, AST)、總膽固醇和LDL膽固醇水平，但不改變血漿甘油三酯或高密度脂蛋白（HDL）膽固醇水平。為了深入了解Psd3下調(diào)導(dǎo)致肝臟脂肪含量降低的機制，作者檢測了參與甘油三酯合成的基因表達水平。與體外實驗結(jié)果一致，在喂食NASH-誘導(dǎo)飲食的小鼠中，Psd3的下調(diào)降低了參與脂肪合成基因（Fasn, Acc1, Scd1）的表達，同時也降低了monocyte chemoattractant protein 1（Ccl2）的表達水平。作者在另一個小鼠模型中再一次證實了上述體內(nèi)數(shù)據(jù)。
             總的來說，該研究鑒定了PSD3中一個新的與肝臟脂肪含量相關(guān)的基因位點rs71519934，該基因位點參與了高危個體對脂肪肝的易感性；并在小鼠、人原代肝細胞以及人類和嚙齒動物肝癌細胞中探究了遺傳關(guān)聯(lián)背后的分子機制：PSD3/Psd3下調(diào)可以保護小鼠免受脂肪肝，并防止脂質(zhì)在人原代肝細胞和肝癌細胞中積累。作者認為需要進行更為深入的機制分析，進而評估PSD3治療FLD的潛力。


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