武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司歡迎您！
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| 027-87561033
PRODUCT CENTER
| 價格 | ￥6800.00 |
| 品牌 | NewEast Biosciences  |
| 產(chǎn)地 | 中國 武漢 |
| 貨號 | 82801 |
| 規(guī)格 | 30 Assays |
| 說明書 | 說明書下載 |
Configuration-specific Monoclonal Antibody Based
Rab35 Activation Assay Kit
Catalog Number：82801
30 assays
產(chǎn)品說明
GTPases的Rab家族調(diào)控真核囊泡膜交通。Rab35具有兩種等離子體細胞膜和內(nèi)體定位，并涉及多種過程，包括t細胞受體循環(huán)，卵黃蛋白循環(huán)和細胞分裂。Rab35調(diào)節(jié)神經(jīng)元樣細胞的神經(jīng)突生長，可誘導(dǎo)突起。目前還沒有直接測定Rab35 GTPases激活的方法。
而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的Rab35活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別特殊構(gòu)象的Rab35結(jié)合蛋白，而不識別Rab35結(jié)合蛋白，進而簡單并且快速的進行Rab35的活性檢測。同時試劑盒中的Rab35-GTP單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中Rab35的活性監(jiān)測。
檢測原理
武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Rab35活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的Rab35-GTP單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的
（樣品需要進行GTPγS活化處理）活性Rab35-GTP的水平。簡言之，特異性識別Rab35活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細胞裂解液中的Rab35-GTP活性
蛋白，然后利用Protein A/G將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用特異性識別Rab35蛋白的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。
試劑盒組份及保存
試劑盒所需自備物品
1. 刺激和未刺激的細胞裂解物；
2. 蛋白酶抑制劑；
3. 4 °C 搖桿或者搖床；
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；
5. 1 M MgCl2；
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；
7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；
8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；
9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；
10 ECL 檢測試劑；
實驗操作步驟
A 試劑制備
1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。
B 樣品處理
貼壁細胞
1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理。
2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
3. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。
5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。
6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因 組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
懸浮細胞
1. 培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。
2. 計數(shù)細胞后離心。
3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。
4. 向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。
5. 反復(fù)吹打細胞進行裂解。
6. 將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。
7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，
將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。
8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。
C.體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）
注意：在細胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10% 的 Rab35 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Rab35 被激活。
1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的 Rab35 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。
2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。
3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。
4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。
5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。
D. 激活 Rab35 的親和沉淀
1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。
2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調(diào)整到1ml
3. 向管中加入 1ul 的活性 Rab35 單克隆抗體。(Cat.# 26922)
4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，
5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。
6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。
7. 5000g，離心 1 分鐘。
8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。
9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。
10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。
11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。
12. 樣品煮沸 5min。
13. 5000g，離心 10s。
E. 蛋白印跡實驗
1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。
2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。
3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。
4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。
5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。
6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋Anti-Rab35 PAb(Cat.# 21078),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 Rab35 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.
8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。
10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。
11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rab35 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考
Rab35 活化分析
純化的 GST- Rab35 蛋白(Cat. No. 10132) 用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的 Rab35進行免疫沉淀(Cat. No. 26922).用 anti Rab35 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21078). 做免疫印跡分析。
最底部圖片；純化的 GST-Rab35 蛋白(Cat. No. 10132)用anti Rab35 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21078).做一個免疫印跡作為參照
| Related Products | |||
| Catalog# | Name | Size | Price |
| 82801 | Rab35 Activation Assay Kit | 30 assays | ￥6800 |
| 26922 | Active Rab35 GTP Monoclonal Antibody | 30 μL | ￥4800 |
| 21078 | Anti Rab35 Rabbit Polyclonal Antibody | 100 μL | ￥2600 |
| Publications: |
| 1. VASP promotes TGF-β activation of hepatic stellate cells by regulating Rab11 dependent plasma membrane targeting of TGF-β receptors Hepatology Volume 61, Issue 1, pages 361–374, January 2015 |
| 2. Rab5 Activity Regulates GLUT4 Sorting into Insulin-Responsive and Non-Insulin-Responsive Endosomal Compartments: A Potential Mechanism for Development of Insulin Resistance Endocrinology. 2014 Sep;155(9):3315-28 |
示例結(jié)果
下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 Rab35 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考
Rab35 活化分析
純化的 GST- Rab35 蛋白(Cat. No. 10132) 用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2) 用抗活性的 Rab35進行免疫沉淀(Cat. No. 26922).用 anti Rab35 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21078). 做免疫印跡分析。
最底部圖片；純化的 GST-Rab35 蛋白(Cat. No. 10132)用anti Rab35 rabbit polyclonal antibody(Cat. No. 21078).做一個免疫印跡作為參照
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